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近日，中南林業科技大學、岳麓山實驗室劉高強課題組在分析化學領域權威期刊Analytical Chemistry（中科院一區Top，IF：8.008）發表了題為“Non-Destructive and Quantitative Analysis of Cell Wall Regeneration in Medicinal Macrofungus Ganoderma lingzhi by Membrane-fusing Fluorescent Probe”的研究論文，采用膜融合熒光探針技術，實現了對重要真菌靈芝原生質體再生過程的實時無損傷定量監測。成果以“封面論文”的方式發表在Analytical Chemistry 2023年第95卷第21期。《Analytical Chemistry》是分析化學領域享有高度學術聲譽的老牌期刊，入選自然指數（Nature Index）全球首批68個期刊之一。論文第一作者為石沐玲博士，通訊作者為劉高強教授；中南林業科技大學為第一單位和通訊作者單位，湖南大學、海南大學為合作單位。

靈芝是一種珍貴的大型藥用真菌，具有廣泛的藥用價值。原生質體是細胞融合和遺傳工程的理想受體，因此，原生質體是研究靈芝細胞的生理、代謝、遺傳等相關科學問題的重要工具。原生質體及其再生細胞壁的評估通常依賴于電子顯微鏡分析，但電子顯微鏡方法不適用于原生質體再生過程的動態監測，因為其樣品必須經過固定和脫水過程，同時，單個顯微圖像提供的信息較為碎片化和離散化，很難量化給出樣本中形態特征的參數；如果要實現樣品的全面研究，需要對每個視圖逐一進行單獨分析，這需要付出大量努力和時間。相比之下，基于熒光的分析方法，能夠對活細胞進行實時檢測和成像；同時熒光標記也可以應用于流式細胞術，利用流式細胞術快速、高能量信息采集和分析的特點，提供樣本整體情況的量化信息。

然而，與細菌等典型微生物相比，大型真菌如靈芝，由于其自身熒光蛋白同源表達的阻礙和缺乏合適的熒光抗體標記，原生質體和再生細胞壁的熒光分析比較困難。針對上述問題，本研究開發了一種能錨定和標記靈芝質膜的特異性質膜探針——TAMRA（羧基四甲基羅丹明）全氟化碳核酸探針（TAMRA perfluorocarbon nucleic acid probe, TPFN），用于靈芝細胞壁再生的無損定量熒光分析。

TPFN探針的組成及工作原理如下圖1所示，探針引入僅由碳和氟組成的安全無毒的烴類化合物全氟化碳鏈作為疏水部分，此部分通過疏水作用能與原生質體質膜錨定，激發出較強的熒光，然后引入核酸作為親水部分，連接全氟化碳鏈和TAMRA熒光分子。TPFN錨定靈芝原生質體質膜后，產生強烈的熒光信號，當細胞壁再生發生時，由于全氟化碳對靈芝細胞膜的選擇性，熒光強度降低，根據熒光信號的變化可以量化靈芝原生質體細胞壁的再生程度，即可以通過熒光信號的強度來指示細胞壁再生的過程。探針的全氟代烷部分具有高疏水性、柔性的雙鏈結構，相比于哺乳動物細胞膜探針常用的脂質分子，其對靈芝細胞膜的錨定具有更好的特異性。探針所采用的寡核苷酸序列使探針具有良好的生物親和性、水溶性，同時賦予探針一定的體積位阻。探針信號由具有綠色激發的TAMRA發出，使探針信號不受真菌自發熒光的影響。經試驗證明探針插膜效率和細胞壁重生的程度成比例關系，進而實現了通過流式和熒光成像手段區分細胞壁的有無，并且可以通過流式統計方法對細胞壁再生過程進行定量分析。

圖1 TPFN的工作原理和化學結構示意圖

其它主要試驗結果見圖2-圖6。

圖2 靈芝菌絲生長菌落（A）、顯微形態（B），以及原生質體（C）及其流式細胞儀檢測（D）

圖3 TPFN與靈芝原生質體的相互作用。多通道流式細胞儀檢測結果（A）和共聚焦熒光顯微結果（B）：TPFN與靈芝原生質體結合后，產生強烈的熒光信號。

圖4 探究TPFN對靈芝細胞膜的錨定功能

圖5 TPFN錨定靈芝原生質體膜的特異性分析

（A）靈芝原生質體；（B）生長36h細胞壁再生后的原生質體；（C）TPFN與原生質體及細胞壁再生原生質體孵育后的流式直方圖；（D）熒光共聚焦顯微鏡觀察TPFN與最初原生質體（上圖）和細胞壁再生原生質體（下圖）的結合特異性

圖6 靈芝原生質體再生過程的定量監測。流式直方圖內的染色細胞比例數值隨著細胞壁再生逐步下降。

本論文通過分析化學手段較好地解決了生物學研究中大型真菌原生質體及其再生的動態監測問題。本工作對功能核酸熒光探針在真菌、特別是多細胞的大型真菌上的應用進行的探索，預期能夠啟發相關研究者們為分子生物學研究常用的真菌細胞轉化等操作提供新的監測手段。此外，開發的熒光核酸探針平臺也具有較好的可拓展性，對其稍作修改或整合后，可適用于其他細胞原生質體的制備、環境應力下細胞壁完整性的檢測，以及用于微生物細胞生物學和生理學研究的可編程膜工程等領域。