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Cas13酶沿著RNA行走的景象。

圖片來源：紐約基因組中心

基于CRISPR的遺傳篩選已幫助科學(xué)家鑒定了鐮狀細胞貧血，癌癥免疫療法，肺癌轉(zhuǎn)移以及許多其他疾病的關(guān)鍵基因。但是，這些基因篩選的范圍有限：它們只能編輯或靶向DNA。對于人類基因組的許多區(qū)域，靶向DNA可能無效，而其他生物（例如冠狀病毒或流感之類的RNA病毒）也無法通過現(xiàn)有的DNA靶向CRISPR篩選完全靶向。

現(xiàn)在，科學(xué)界的一個重要的新資源今天發(fā)表在《Nature Biotechnology》雜志上，紐約基因組中心和紐約大學(xué)的Neville Sanjana博士實驗室的研究人員開發(fā)了一種新的靶向RNA的CRISPR篩選技術(shù)。

研究人員利用了最近發(fā)現(xiàn)的一種名為Cas13的CRISPR酶，該酶靶向RNA而不是DNA。利用Cas13，他們設(shè)計了一個優(yōu)化的平臺，用于在人類細胞的RNA水平上進行大規(guī)模平行的基因篩選。這種篩選技術(shù)可以用于了解RNA調(diào)控的許多方面，并識別非編碼RNA的功能，非編碼RNA是產(chǎn)生的RNA分子，但不編碼蛋白質(zhì)。

通過針對人類RNA轉(zhuǎn)錄物中成千上萬個不同的位點，研究人員開發(fā)了一種基于機器學(xué)習(xí)的預(yù)測模型，以加速識別最有效的Cas13指導(dǎo)RNA。研究人員可以通過交互式網(wǎng)站和開源工具箱使用這項新技術(shù)，以預(yù)測定制RNA靶標(biāo)的指導(dǎo)RNA效率，并為所有人類蛋白質(zhì)編碼基因提供預(yù)先設(shè)計的指導(dǎo)RNA。

這項研究的作者Sanjana博士說：“我們預(yù)計靶向RNA的Cas13酶將對分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用產(chǎn)生重大影響，但是我們對于高靶向效力的指導(dǎo)RNA設(shè)計知之甚少。” “我們打算通過深入而系統(tǒng)的研究來改變這一點，以開發(fā)出最有效的指南設(shè)計的關(guān)鍵原理和預(yù)測模型。”

Sanjana博士是紐約基因組中心的核心教員，紐約大學(xué)生物學(xué)助理教授，紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)與生理學(xué)助理教授。

Cas13酶是VI型CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）酶，最近被鑒定為可設(shè)計的RNA指導(dǎo)的RNA靶向蛋白，具有核酸酶活性，可在不改變基因組的情況下實現(xiàn)靶基因敲低。這種特性使Cas13成為一種潛在的重要治療手段，可以在不永久改變基因組序列的情況下影響基因表達。

“這是我們在紐約基因組中心培育和開發(fā)的技術(shù)創(chuàng)新。這項來自Sanjana實驗室的最新CRISPR技術(shù)對推進基因組學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域具有令人興奮的意義。” ，紐約基因組中心Evnin家庭科學(xué)總監(jiān)兼首席執(zhí)行官Tom Maniatis博士說。

博士后科學(xué)家Hans-Hermann Wessels和該研究的共同一作、博士生Alejandro Méndez-Mancilla開發(fā)了一套新的基于Cas13的工具，并在哺乳動物細胞中進行了轉(zhuǎn)錄平鋪和排列篩選。研究人員總共收集了超過24,000個RNA靶向引導(dǎo)的信息。

Wessels博士說：“我們在許多不同的轉(zhuǎn)錄本中加入了引導(dǎo)RNA，其中包括幾個人類基因，我們可以通過抗體染色和流式細胞術(shù)輕松地檢測轉(zhuǎn)錄本的敲低。” “在此過程中，我們發(fā)現(xiàn)了一些有趣的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)，這可能會擴大靶向RNA的Cas13酶的應(yīng)用。”

例如，研究小組的發(fā)現(xiàn)向?qū)NA的哪些區(qū)域?qū)τ谧R別靶RNA更為重要。他們使用成千上萬個與它們的靶RNA具有1、2或3個堿基錯配的引導(dǎo)RNA，確定了一個關(guān)鍵的“種子”區(qū)域，該區(qū)域?qū)RISPR引導(dǎo)與靶之間的錯配非常敏感。這一發(fā)現(xiàn)將有助于科學(xué)家設(shè)計指導(dǎo)性RNA，以避免非目標(biāo)RNA上的脫靶活性。由于典型的人類細胞表達約100,000個RNA，因此，準(zhǔn)確定位Cas13的預(yù)定靶點對于篩選和治療應(yīng)用至關(guān)重要。

除了進一步了解Cas13脫靶外，“種子”區(qū)域還可以用于下一代生物傳感器，從而可以更精確地區(qū)分密切相關(guān)的RNA物種。總體而言，這項研究將以前的Cas13研究在哺乳動物細胞中的數(shù)據(jù)點數(shù)量增加了兩個數(shù)量級以上。

共同第一作者Méndez-Mancilla說：“使用優(yōu)化的Cas13篩選系統(tǒng)靶向非編碼RNA令我們特別興奮。” “這極大地擴展了CRISPR工具箱，用于正向遺傳和轉(zhuǎn)錄組篩選。” 在這項研究中，研究人員注意到以信使RNA的不同蛋白質(zhì)編碼和非編碼元件為靶標(biāo)時，蛋白質(zhì)敲除存在顯著差異，并發(fā)現(xiàn)參與轉(zhuǎn)錄物加工和剪接的Cas13與其他RNA結(jié)合蛋白競爭的證據(jù)。

該團隊最近利用他們的指導(dǎo)RNA預(yù)測模型進行了特別關(guān)鍵的分析：COVID-19突發(fā)公共衛(wèi)生事件是由于冠狀病毒引起的，該冠狀病毒包含RNA（而非DNA）基因組。使用從大規(guī)模平行篩選中得出的模型，研究人員確定了最佳指導(dǎo)RNA，可用于未來檢測和治療應(yīng)用。

文獻來源:

Wessels, H., Méndez-Mancilla, A., Guo, X. et al. Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design. Nat Biotechnol (2020). doi.org/10.1038/s41587-020-0456-9

https://www.nature.com/articles/s41587-020-0456-9

新聞報道來源：

https://phys.org/news/2020-03-kind-crispr-technology-rna-viruses.html

作者單位：New York Genome Center

譯文校稿：LuLu